【新技术】3D肿瘤显微镜可对肿瘤组织进行三维角度分析，简化肿瘤诊断！价格便宜易操作！

导言：传统的肿瘤诊断是玻片成像技术，容易耗损病例组织，也不能全方面检查病理组织，且处理周期长。为了改善这种状况，维也纳工业大学和慕尼黑工业大学一起开发了一项新技术：不仅可以查看肿瘤周围组织健康程度、切割干净程度以及判断后续是否需要手术或放疗。

目前临床中病理检查主要使用玻片成像技术（WSI），该技术可以扫描整个玻璃安装的H＆E染色切片。生成的图像可以使用专门设计的软件进行分析。

该检查的缺点是局部切片，不能完全查看到病理组织的所有情况。由于这种方法的不可逆性，组织已完全用完，因此不再可用于某些分析，例如用于PD-L1的免疫组织化学测试。在PD-L1测试中，未染色的切片不应存放超过2-3个月，否则存在假阴性结果的风险。这意味着患者可能被剥夺了潜在的高效抗肿瘤免疫疗法。而且，这项检查费时费力，因此很难应用于临床。

近年来，全世界的科学家通过发明新的病理组织成像技术，改善这种状况。科学家发现了一种新颖的组织清除和光学方法，该方法具有很高的潜力，可以为肿瘤及其微环境提供全面的三维视图。这项方法价格便宜、快速且易操作，因此可广泛应用临床术后病理检查。

最近，维也纳工业大学（维也纳）和慕尼黑工业大学一起开发了一项新技术，文章发表在《Scientific reports》上，题为“3D histopathology of human tumours by fast clearing and ultramicroscopy”。这项新技术可以用3D方式去除病理组织，而无需肿瘤切片，显着提高癌症诊断的可靠性！

图 文章发表 来源：《科学报告》

拯救生命的组织样本

维也纳工业大学固体电子研究所的 Hans Ulrich Dodt 教授说：“在显微镜下，您可以看到切除的肿瘤是否被健康组织所围绕，如果是这样的情况，患者只需要等待恢复。如果不是这种情况下，患者需要进行后续手术或放射治疗，尤其是乳腺癌经常发生这种情况。”

切片问题在于，永远不可能完全检查到整个肿瘤组织。通常，每5毫米组织制作一个约4微米厚的切片。这意味着只检查带了整个肿瘤体积的千分之一。而且在关键区域，还需要选择更精细的间距，但是不可能以此方式研究到整个组织。

超显微镜的出现

但是，一种超显微镜技术可以使整个肿瘤可以以3D模式呈现。Inna Sabdyusheva开发了一种化学方法来“清除”乳腺癌样品，然后使它们变得透明，但结构保持不变，所以癌细胞仍然可以被识别。

然后在超显微镜下检查透明样品，薄层激光束即所谓的“光片”穿透组织。然后对样品进行逐层分析，即使从未切过肿瘤，计算机也可以显示肿瘤的所有切片。通过这种方式，可以看到被癌细胞堵塞的乳腺导管。

超显微3D肿瘤显微镜操作步骤

为了清除肿瘤，我们提出了一种制备技术，该技术包括三个步骤：

（a）用福尔马林/ 5-磺基水杨酸固定和增强组织自发荧光

（b）用2,2-二甲氧基丙烷进行的超快活性化学脱水

（c）在最高56°C下与二苄基醚匹配的折射率

清除后，对肿瘤切除部位成像。图像经过计算处理后以增强对比度和去除伪影，然后进行3D重建。

用pathoDISCO进行组织处理；（a）实体肿瘤的可逆组织清除和3D成像工作流程；（b）样品的体积收缩率比较（％），用pathoDISCO和3DISCO清除（n = 16）；（c）从手术到3D重建的组织处理时间表

图像采集

使用定制的超显微设置获取了基于选择性增强的肿瘤切除部位自发荧光的图像。我们建立了最佳的自发荧光激发是通过使用488 nm波长的激光实现的。所发出的荧光通过光学带通滤光片过滤，截止波长为550±49 nm。

记录后，对获取的图像进行对比度受限的自适应直方图平衡（CLAHE）46，通过频域47中的定向空间滤波去除条纹伪影，以及对最终清晰度进行锐化掩盖。我们发现，按此处理步骤，可以显着提高对比度。为了通过CLAHE获得最佳结果，图像中的灰度级数应尽可能高（例如，对应于65,535灰度级的16位），因为该算法会将不明显的小亮度差异转换为人眼可以很好感知的较大差异。

（a）超显微设置：用于荧光激发的蓝宝石激光器单元（未显示），分束器立方（BSC），45度银镜（M），两个光片发生器单元（LSG），两个可移动的线性平台（LS）沿光束传播轴（z）的LSG单元，用于将光片的中心叠加在生物样品的中心；计算机控制的平台，用于将样品垂直移动通过光片（VS）；石英容器（QC） ，其中装有成像介质（DBE）。检测单元包括配备有用于补偿折射率失配的调制器（MO）的×2，×4或×16物镜，配备有带通滤光片（BPF）轮的管状透镜（TL）和CMOS相机。（b，c）以×2放大率记录癌症样品。

由于所有应用的图像处理步骤都在2D图像上进行操作，因此它们在计算上不会耗费大量成本，例如3D反卷积方法（需要输入三维数据）。因此，整个记录处理链基本上可以在记录过程中使用最新的多处理器计算机实时地执行。

3D重建

预处理后，使用可视化软件AMIRA 6.7（德国Thermofisher）三维重建了600