CAR-NK细胞用于癌症治疗的新希望

前言

人类自然杀伤细胞(NK) 占所有循环淋巴细胞的15%。NK细胞发现于20世纪70年代，主要与杀死感染的微生物和恶性转化的同种异体和自体细胞有关。NK细胞表现出抗肿瘤细胞毒性，无需事先致敏和产生细胞因子以及调节各种免疫反应的趋化因子。人外周血NK细胞可分为CD56bright和CD56dim两大类。CD56brightNK细胞通常被认为是低细胞毒性的细胞因子产生细胞，而CD56dimNK细胞则具有潜在的细胞毒性。由于NK细胞能够识别和分解肿瘤细胞，以NK细胞为基础的肿瘤免疫治疗领域已经到了一个激动人心的关头。

嵌合抗原受体（CAR）是一种受体蛋白，它赋予免疫细胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。它的细胞外抗原结合域通常为单链抗体（scFv），可以识别肿瘤细胞表面的特异性抗原。细胞内激活的信号结构域，如CD28、4-1BB（CD137）和OX40，通常起到触发免疫细胞激活和杀伤的作用。表达CAR的T细胞能迅速识别肿瘤表面抗原，进而裂解肿瘤细胞。CAR-T细胞免疫治疗在治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）和淋巴瘤等血液肿瘤方面取得了巨大的成就。然而尽管CAR-T细胞免疫治疗技术发展迅速，但在临床应用中仍存在一些不足，例如在实体瘤的治疗中显示出很低的疗效；此外，大多数的CAR-T细胞免疫疗法需要自体过继细胞移植，因为除非处理HLA屏障，否则异基因T细胞可能导致移植物抗宿主病（GVHD）；另外，CAR-T细胞免疫治疗可能会产生一些副作用，对患者的生命造成危害，如细胞因子释放综合征。最新的研究表明，表达CAR的NK细胞可能会克服CAR-T细胞的上述缺陷，并显示出显著的抗肿瘤作用。CAR-NK细胞在肿瘤的免疫治疗中展现出广阔的前景。

CAR-NK细胞免疫治疗的优势

首先，在临床应用中，CAR-NK细胞免疫疗法比CAR-T细胞免疫疗法更安全，而且NK细胞的安全性已在一些临床领域得到验证。例如，一些I/II期试验显示，同种异体NK细胞输注耐受性良好，不会引起GVHD和明显的毒性。因此，NK细胞是一种适应性更强的CAR载体，而不仅仅局限于自体细胞。

CAR-T细胞免疫治疗的主要副作用之一是由于CAR-T细胞的持续存在而产生的靶向效应。相反，CAR-NK细胞的寿命很短，几乎不会产生靶向效应。另外，NK细胞产生的细胞因子种类与T淋巴细胞产生的细胞因子种类有很大不同。活跃的NK细胞通常产生IFN-γ和粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），而CAR-T细胞通常通过分泌促炎性细胞因子如TNF-α、IL-1和IL-6诱导细胞因子风暴。

第二，除了通过单链抗体识别肿瘤表面抗原来抑制癌细胞外，NK细胞还可以通过多种受体识别各种配体来抑制癌细胞，例如自然细胞毒性受体（NKp46、NKp44和NKp30）、NKG2D和DNAM-1（CD226）。这些NK细胞受体通常识别在免疫细胞或长期治疗压力下肿瘤细胞上表达的应激诱导配体。此外，NK细胞通过FcγRIII（CD16）诱导抗体依赖性细胞毒性。因此，CAR-NK细胞可通过CAR依赖和NK细胞受体依赖性途径抑制癌细胞，从而消除肿瘤抗原阳性癌细胞或表达NK细胞受体配体的癌细胞。临床试验表明，CAR-T细胞不能消除高度异质性的癌细胞，但是CAR-NK细胞能够有效地杀死长期治疗后可能改变其表型的残留肿瘤细胞。

最后，NK细胞在临床样本中非常丰富，可以从外周血（PB）、脐带血（UCB）、人类胚胎干细胞（HESC）、诱导多能干细胞（IPSC）甚至NK-92细胞系中产生。NK-92细胞提供了一个均匀的细胞群，并且可以在适当的培养条件下很容易地扩大，以进行广泛的临床应用。但是，由于其肿瘤细胞系来源，必须在输注前进行辐照。相反，活跃的PB-NK细胞表达广泛的受体，无需辐射即可利用，这使得它们能够在体内生成。来源于iPSCs或hESCs的NK细胞结合了PB-NK和NK-92细胞的优点，表现出与PB-NK细胞相似的表型，是一个同质的群体。更重要的是，通过采用非病毒转基因方法，CAR可以很容易地在人胚胎干细胞和/或iPSC来源的NK细胞中表达。

CAR-NK细胞免疫治疗的研究现状

血液瘤

临床前研究表明，CD19-CAR-NK细胞对血液系统肿瘤有很高的应答率，并且易于制造，与目前的CAR-T细胞免疫疗法相比，这是一个巨大的进步。CD19-CAR修饰的NK细胞具有比CAR-T更明显的优势，有望显示出更好的抗肿瘤作用。除了CD19外，淋巴瘤和白血病的CAR-NK细胞临床研究也针对CD7（NCT02742727）和CD33（NCT02944162）。目前，有几种针对血液恶性肿瘤的CAR-NK细胞临床试验正在进行中。

实体瘤

CAR治疗的一个主要障碍是缺乏对实体瘤的疗效。这是由于肿瘤灌注不良、TAA异质性和实体瘤伴发的免疫抑制肿瘤微环境（TME）所致。

CAR-NK疗法试图解决这些问题，一些临床试验已经应用于实体恶性肿瘤的治疗。在实体瘤中进展最为广泛的CAR-NK疗法包括检查点分子程序性细胞死亡蛋白-1配体（PD-L1）以及常见的肿瘤相关抗原HER2和MUC1为靶点。

PD-L1在TME和免疫抑制细胞的几种癌症类型中上调。一种新的NK-92细胞系被设计成靶向PD-L1、ER保留的IL-2和高亲和力CD16的CAR，称为PD-L1靶向haNK（t-haNK）。令人兴奋的临床前数据表明，这些细胞在体外对15种肿瘤细胞株具有特异的抗肿瘤作用，在体内对三阴性乳腺癌、膀胱肿瘤和肺癌具有很强的抗肿瘤作用。QUITL3.064 I期临床试验（NCT04050709）目前正在进行，PD-L1 t-haNK联合其他药物评估局部晚期或转移性胰腺癌患者的安全性和有效性也在进行中（NCT0439099）。

HER2在几种癌症中过度表达，如乳腺癌、胃癌、食管癌、卵巢癌和子宫内膜癌。HER2也在80%的胶质母细胞瘤中表达，并且与低生存率相关。因此，HER2是CAR治疗的一个非常有吸引力的靶点。HER2-CAR-T治疗胶质母细胞瘤已经显示出这些细胞被转移到肿瘤中，但是在TME中高效应功能的T细胞导致抗原丢失变体的快速选择。ErbB2-NK-92/5.28z CAR-NK将在潜在抗原丢失的情况下保持效应器功能，从而使过继转移细胞的细胞毒功能恢复到基线NK细胞的细胞毒功能。这项HER2-CAR-NK治疗正在一项3+3剂量递增I期临床试验（CAR2BRAIN；NCT0338978）中。

MUC1是一种在导管上皮细胞上表达的高度糖基化跨膜糖蛋白，其在人类B细胞和T细胞上的表达存在争议。MUC1在多种癌症类型中过度表达，使其成为CAR-T治疗的合适靶点。然而，CAR-T疗法已被证明是不成功的，因为免疫抑制的TME。为了规避TME介导的免疫抑制，CAR-NK细胞被设计表达带有CD28和CD137信号结构域的MUC1-CAR和截短的PD-1肽（MUC1-CAR-NK-92）。这些细胞在体外和体内均能杀伤MUC1靶细胞。最近完成了一项I期临床试验（NCT02839954），评估了Muc1-CAR-NK-92在Muc1阳性复发或难治性实体瘤患者中的安全性和有效性。13例PD-L1和MUC1阳性肿瘤患者中，3名退出，9名病情稳定，1名患者病情进展。主要的观察指标是确定Muc1-CAR-NK-92细胞的毒性，值得注意的是，试验中没有任何患者出现细胞因子风暴或骨髓抑制的迹象。

CAR-NK细胞面临的临床应用障碍

体外扩增NK细胞是CAR-NK细胞免疫治疗的第一道障碍。单个供体的NK细胞数量不足以进行治疗，这使得NK细胞的扩张和激活变得非常关键。这一生产过程通常需要两到三周的时间来培养NK细胞和某些细胞因子（IL-2或与IL-15或抗CD3单克隆抗体联合使用）。尽管辐照过的K562-mb15-4-1BBL细胞作为饲料可以改善NK细胞增殖过程中细胞的生长，但供体细胞数量的可用性仍然是一个障碍。此外，必须完全清除T细胞，以防止GVHD。因此，如何获得足够的NK细胞仍是一个挑战。

选择合适的方法将CAR转化为NK细胞是CAR-NK细胞免疫治疗的关键。到目前为止，病毒载体和非病毒载体都被用来转化CAR。虽然逆转录病毒载体的转染效率很高，但它可能会引起插入突变、致癌和其他不良反应。而慢病毒载体尽管显示出较低的插入突变发生率，但其对外周血NK细胞的转染效率低至20%。

mRNA转染CAR-NK细胞也被认为是一种安全、实用的转染方法。研究表明，在异种移植肿瘤模型中，用mRNA方法电穿孔24小时后受体表达水平超过80%，转染mRNA的NK细胞表现出明显的细胞毒性。最近有研究表明，转染mRNA可以有效地避免CAR修饰免疫疗法临床应用的一个重要限制因素“靶向非肿瘤”毒性。然而，通过电穿孔方法转染mRNA的CAR-NK细胞的抗肿瘤作用将是暂时的，因为CARs的表达水平不会超过3天。

新一代的CAR-NK

一些研究小组正在探索不同的机制来有效地对抗抗原丢失和免疫抑制TME，从而将提高CAR-NK治疗策略的治疗寿命和疗效，并可能成为下一代CAR-NK治疗的支柱。

为了避免抗原逃逸，Mitwasi和他的同事开发了一种通用型CAR（UniCAR），带有开关，以提高安全性和可控性。这项技术首先在针对E5B9的CAR-T细胞上得到验证，E5B9是核抗原La-SS/B的肽表位。由于在细胞表面没有发现这种蛋白，CAR-T必须通过一种称为靶模块（TM）的双特异性分子定向到肿瘤。TMs通常以E5B9肽表位融合到抗TAA的单链抗体上。不同的TM可以联合应用，以同时针对多个TAA，诱导CARs反应肽的异质性，而不存在靶向效应的风险。

Mitwasi等人开发了一个表达UniCAR的NK-92细胞系和一个TM，其中E5B9表位连接到IgG4主干上的抗GD2单抗。GD2在多种人类肿瘤中高表达，是神经母细胞瘤的免疫治疗靶点之一。以表达GD2的神经母细胞瘤和黑色素瘤细胞为靶点的UniCAR NK-92在体外表现出抗肿瘤细胞毒性，已准备进一步的临床开发。

CAR治疗面临的另一个挑战是TME。为避免免疫抑制性TME，Wang等构建了NK-92细胞，表达由细胞外TGFβRII融合到激活受体NKG2D的细胞内信号转导域组成的修饰CAR（TGFβRII-NKG2D，称为NK-92-TN）。本质上，这种融合将免疫抑制剂TME产生的TGF-β传递的信号转换为激活信号。体外培养的NK-92-TN细胞对TGF-β抑制有抵抗力，无NKG2D下调，TGF-β共培养后杀伤能力和IFN-γ产生增加。虽然体外实验数据看起来很有希望，但在体内，NK-92-TN的抗肿瘤活性并不显著，终点肿瘤重量的减少很小。在这方面还需要更深入的研究。

展望

自然杀伤细胞是一组独特的抗肿瘤效应细胞，具有不受MHC限制的细胞毒性、产生细胞因子和免疫记忆等功能，使其成为先天性和适应性免疫反应系统中的关键角色。CAR-NK细胞疗法是一个很有前途的临床研究领域，对某些癌症患者具有良好的安全性和初步疗效。与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞具有自己独特的优点，但仍面临着一些挑战。这些挑战包括细胞增殖的改善，使细胞毒性的激活更有效，以及最终找到NK细胞的最佳重建方法。相信解决好这些问题，基于NK细胞优秀的抗肿瘤血统，极有可能在CAR修饰的武装下为肿瘤治疗带来新的突破。

参考文献：

1.CAR-expressing NK cells for cancer therapy: a new hope. BiosciTrends. 2020 Sep 6.

2. Natural Born Killers: NK Cells in Cancer Therapy. Cancers (Basel). 2020 Jul 31;12(8):2131

3.Exploring the NK cell platform for cancer immunotherapy. Nat RevClin Oncol. 2020 Sep 15.

4. clinicaltrials.gov